Эпидемиологическое значение окружающей домашней среды у больных муковисцидозом с хронической инфекцией легких, вызванной Pseudomonas aeruginosa

Введение

Кистозный фиброз (муковисцидоз) — это генетическое заболевание, которое требует пожизненного лечения. Прогноз течения заболевания напрямую связан со степенью поражения бронхолегочной системы.

В течение многих лет (2005–2025 гг.) проводилась исследовательская работа в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» по изучению ведущих возбудителей хронической инфекции легких у пациентов с муковисцидозом (МВ) совместно с научно-клиническим отделом муковисцидоза ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова») (проф. Н.И. Капрановым, проф. Е.И. Кондратьевой) [1]. Полученные результаты подтвердили длительную персистенцию бактерий Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia complex, Achromobactrer spp. при хронической инфекции легких у пациентов с муковисцидозом [2][3][4].

Молекулярно-­генетический мониторинг хронической инфекции, вызванной P. аeruginosa, показал, что такая инфекция может быть связана с персистенцией одного генотипа, одновременным присутствием нескольких генотипов (генотипическая гетерогенность) или последовательным изменением генотипов P. aeruginosa [2][3]. Эта динамика отражает постоянное суперинфицирование или реинфицирование детей бактериями P. aeruginosa, что препятствует эрадикации инфекции, несмотря на проводимую антибактериальную терапию.

Молекулярные исследования изолятов P. aeruginosa, выделенных от разных больных с МВ, показали, что они характеризуются генетическим разнообразием: P. aeruginosa, выделенные от 82,2 % пациентов, принадлежали к разным генотипам [4]. Такое генетическое разнообразие свидетельствует о различных источниках инфекции, преимущественно внегоспитальных.

Pseudomonas aeruginosa — широко распространенный сапрофит, обитающий в окружающей среде, включая воду, почву и растения. Этот микроорганизм не зависит от хозяина и активно колонизирует влажные поверхности в домашних условиях, такие как раковины, душевые кабины, кухонные покрытия, текстиль, игрушки и растения. На этих субстратах P. aeruginosa формирует биопленки, обеспечивающие длительное сохранение в окружающей среде и устойчивость к бытовым дезинфицирующим средствам [5–12].

Эпидемиологические исследования за рубежом подтверждают, что бактерии P. aeruginosa могут сохраняться в домашней среде детей с МВ [13][14][15]. В Российской Федерации подобные исследования остаются ограниченными [16]. В связи с этим исследование домашней среды играет ключевую роль в раскрытии источников реинфицирования, суперинфицирования бактериями P. aeruginosa и разработке стратегий предотвращения инфекций у пациентов с МВ.

Цель — определить значение окружающей домашней среды в инфицировании детей, больных муковисцидозом, бактериями P. aeruginosa и оценить эффективность профилактических мер в домашних условиях.

Материалы и методы

В ходе исследования были описаны и проанализированы условия проживания 27 детей с хронической инфекцией легких, вызванной P. aeruginosa, страдающих МВ, и их семей. Опрос родителей проводился с помощью специально разработанных анкет «Изучение внешней среды и бытовых условий, в которых проживают дети с МВ». Анкеты содержали информацию о наименованиях моющего средства (МС) и дезинфицирующего средства (ДС) для ухода за ингалятором (небулайзером), наименования МС и ДС, используемых в санузле, время их экспозиции, способ стерилизации и метод сушки ингалятора; сведения о ребенке (диагноз, дату рождения), состав семьи и наличие няни, ухаживающей за ребенком, наличие хронических бронхолегочных заболеваний у членов семьи, тип санузла (совмещенный, раздельный), наличие животных.

Для исследования внешней среды пациентов с МВ в негоспитальных условиях проводили бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов домашней среды. Отбор проб с поверхностей изучаемых объектов осуществляли методом смывов в соответствии с методическими рекомендациями [17]. Исследовано 265 проб, взятых с домашней внешней среды 27 детей (в том числе 3 в динамике). Пробы были взяты с поверхностей следующих объектов: маска ингалятора до ингаляции, после ингаляции и после обработки; камера ингалятора до ингаляции, после ингаляции и после обработки; слив раковины до уборки, чистящая поверхность зубной щетки, фильтр компрессора ингалятора.

Идентификацию проводили общепринятыми микробиологическими и биохимическими методами, используя алгоритм микробиологической диагностики, разработанный сотрудниками лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» [18]. Метод РАПД-ПЦР (Random Amplified Polymorphic DNA) с праймером Short 1 («Синтол») и методика MLST (по протоколу Curran B.) были использованы для проведения генотипирования [19].

Результаты

Условия проживания были изучены в семьях 27 детей (рис. 1). Было выявлено, что 59,3 % семей, в которых находятся дети с МВ, состояли из 4–6 человек. В 96,3 % семей за детьми ухаживали только близкие родственники. Няни участвуют в уходе за детьми в 4 % семей. Родственники 18,5 % детей имели хронические бронхолегочные заболевания. В семьях 48 % детей есть домашние животные. В квартирах 48,1 % детей санузел раздельный.

92 % семей для очистки и дезинфекции ингаляторов используют стерилизатор с сушкой. Из них 14,8 % родителей не указали длительность стерилизации. 7,4 % стерилизуют в течение 10 мин, 48,1 % — от 12 до 20 мин, 14,8 % — от 20 до 30 мин, 7,4 % — от 30 до 40 мин (рис. 2). Стерилизатор без сушки используют 4 % семей и при этом высушивание проводят на чистых поверхностях. 4 % семей стерилизуют детали ингалятора кипячением при 100 °C в течение 10 мин, после протирают одноразовыми тканевыми салфетками.

26 % семей детей, страдающих муковисцидозом, не использовали МС или ДС для ухода за ингаляторами. Профессиональными дезинфектантами обрабатывали ингаляторы 44,4 % семей, бытовые средства для мытья посуды применяли 29,6 % семей. 25,9 % семей уход за ингалятором и его очистку проводили с использованием различных ДС.

Для дезинфекции санузла во время уборки бытовые МС применяли 51,9 % семей, а профессиональные — 48,1 % (рис. 4). 36 % семей не выдерживают определенное время дезинфекции. 32 % семей дезинфицируют в течение 10–20 минут, 4 % — 30–60 мин, 8 % семей проводили дезинфекцию более часа. Заливали на ночь сливы раковин только 16 % семей.

Итак, из проведенного анализа анкетных данных следует, что в связи с использованием различных методов стерилизации и дезинфекции ингаляторов, санузла и наличия сопутствующих хронических инфекций у членов семьи существуют риски инфицирования детей больных МВ. К группе риска можно отнести 26 % детей, больных МВ, в семьях которых не использовали МС или ДС для ухода за ингаляторами, и 41 % семей, которые не выдерживали строго определенное время дезинфекции раковин. К группе риска можно также отнести 18,5 % детей, родственники которых имели хронические бронхолегочные заболевания, в том числе у одного родственника, не страдающего муковисцидозом, была обнаружена хроническая инфекция легких, вызванная P. aeruginosa, вследствие этого нельзя исключить, что данный человек может являться источником инфекции. Поэтому необходимо проводить бактериологические исследования микрофлоры респираторного тракта не только детей с МВ, но и ближайших родственников, проживающих с ними.

Результаты исследования микробной контаминации объектов домашней среды продемонстрировали разную степень обсемененности (рис. 5). Наибольший процент высевов микроорганизмов выявлен в сливах раковин (83 %), из внутренней поверхности маски после ингаляции (63 %) и с чистящей поверхности зубных щеток (50 %).

В сливах раковин обнаружили различные микроорганизмы: P. aeruginosa, E. coli, C. freundii, K. oxitoca, P. mirabilis, S. maltophilia, E. falsenii (W. falsenii) Streptococcus pneumoniae, Achromobacter spp. (A. insuavis, A. insolitus, A. pichaundii), Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. (A. ursingii, A. junnii) и другие представители неферментирующих грамотрицательных бактерий, представленные на рисунке 6. Кроме того, выделяли бактерии рода Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis), при этом S. aureus отсутствовал. Из 20 % cмывов высевали бактерии P. aeruginosa. 15 % (4/27) раковин не были контаминированы бактериями, из них 2 объекта заливали на ночь хлорсодержащим средством, для дезинфекции третьей раковины использовали два средства одновременно: хлорсодержащее и моющее средство.

Микробный пейзаж объектов домашней среды и ингаляторов представлен в таблице 1. Микроорганизмами Aсinetobacter lwoffii, S. aureus, Staphylococcus saprophyticus были контаминированы маски до ингаляции. Бактерии S. aureus и S. adhaesiva были высеяны с ингаляторных камер до ингаляции. A. lwoffii, S. aureus, Sphingomonas adhaesiva были выделены с объектов ингаляторов, время стерилизации которых у одного из детей составляло 10 мин, у второго — 20 мин, а у третьего не было указано. Это может свидетельствовать о том, что время стерилизации было недостаточным.

Микробиоценоз масок после ингаляции в 81 % случаев был представлен нормальной микрофлорой ротовой полости, в 2 % случаев выделяли P. aeruginosa, в 12 % — S. aureus, в 5 % случаев — Candida parapsilosis (рис. 7).

Для проверки эффективности дезинфекции ингаляторов проводили посевы смывов после их обработки. Поверхности 22 % объектов ингалятора (масок и камер) после дезинфекции были контаминированы микроорганизмами, среди которых выделяли S. aureus, Сandida albicans, A. johnsoni (табл. 1). Эти ингаляторы были обработаны только бытовыми моющими средствами или моющие и дезинфицирующие средства вовсе не применялись.

С чистящей поверхности 50 % зубных щеток высевали грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы. Из них — 4 % P. aeruginosa, 17 % — S. aureus, 9 % — A. lwoffii. 70 % выделенных микроорганизмов при исследовании зубных щеток были представителями нормальной микрофлоры ротовой полости человека.

33 % смывов с фильтров компрессора ингалятора содержали микроорганизмы (рис. 5). Из смывов с наличием роста микроорганизмов были выделены Aspergillus niger — 25 %, S. aureus — 10 %, A. lwoffii — 5 %.

На момент мониторинга домашней среды 27 семей детей с МВ проводили микробиологическое исследование мокроты и мазков из зева, и только у 6 детей (№ S6, S13, G15, D23, N29, N30) высевали P. aeruginosa. У 4 из них из сливов раковин в домашних условиях были выделены бактерии P. aeruginosa (табл. 2).

Из 21 ребенка, у которых из мокроты P. aeruginosa не высевалась на момент мониторинга, в 6 (29 %) случаях выявлена контаминация объектов домашней среды бактериями P. aeruginosa. У больного L10 выделяли P. aeruginosa с чистящей поверхности зубной щетки и из слива раковины. У больного B11 высевали P. aeruginosa с ингаляторной маски после ингаляции. У 4 больных (G14, Y17, K19, S22) P. aeruginosa выделяли из сливов раковин (табл. 2).

Исследование генетического родства двух изолятов P. aeruginosa 3462r1 и 3462z1, выделенных с чистящей поверхности зубной щетки и раковины больного L10 в RAPD-PCR, показало, что они являются родственными штаммами и относятся по RAPD к 138-му кластеру (рис. 8а). Изоляты 3394r и 3394–2, выделенные из слива раковины и мокроты больного S6 (рис. 8б), также оказались родственными и принадлежали к 45-му кластеру, ST 2390.

Генотипы изолятов P. aeruginosa, выделенные из слива раковины и мокроты больных G15 и D23, отличались. В домашней среде пациента G15 были выделены изоляты P. aeruginosa, генотипы которых отнесли к 141-му и 142-му кластерам по RAPD, а у больного D23 генотипы P. aeruginosa — к 146-му и 147-му кластерам.

Домашнюю среду трех пациентов (C20, S4 и S13) исследовали в динамике. У пациента С20 при первичном исследовании были контаминированы камера ингалятора (после обработки) — бактериями S. aureus, фильтр компрессора — микроорганизмами Candida albicans, Aspergillus niger, S. aureus. При повторном исследовании спустя 18 мес. данные микроорганизмы отсутствовали на указанных объектах. Но из слива раковины выделяли Pseudomonas veronii, Escherichia coli.

У пациента S4 при первичном исследовании с маски ингалятора после обработки высевали грибы рода Candida, с поверхности ингаляторной камеры (до процедуры) — S. adhaesiva, а из слива раковины — A. lwoffii. При следующем исследовании, через 12 мес., камера ингалятора и маска не были контаминированы микроорганизмами, а из слива раковины высеяли бактерии P. aeruginosa. На момент исследования окружающей домашней среды посев P. aeruginosa из мокроты ребенка был отрицательный. Ранее у данного больного регистрировали положительные посевы P. aeruginosa.

У пациента S13 при первичном исследовании объекты камеры ингалятора не были контаминированы микроорганизмами, а из слива раковины высевали бактерии P. aeruginosa, P. putida, Sphingomonas spp. Через 6 мес. при исследовании домашней среды данного ребенка из слива раковины вновь высевали P. aeruginosa. А результат исследования мокроты на P. aeruginosa был отрицательный.

На основании анализа данных в динамике установлено, что используемые в бытовых условиях способы дезинфекции раковины не были эффективны в отношении синегнойной палочки. Неэффективная дезинфекция объектов домашней среды является фактором риска реинфекции бактериями P. aeruginosa.

Обсуждение

Эпидемиологические исследования домашней среды больных МВ были проведены главным образом в зарубежных странах [13][14][15]. M.E. Purdy-Gibson и соавт. исследовали домашнюю среду пациентов с муковисцидозом и больных, не страдающих муковисцидозом, и выявили, что в 28 % смывов, взятых из сливов раковин в домашних условиях больных МВ, выделялась P. aeruginosa [13]. Это более чем в восемь раз превышало частоту контаминации бактерий в домашней среде контрольной группы. Исследователи P. Schelstraete, S. Van Daele изучали домашнюю среду 50 пациентов с муковисцидозом. P. aeruginosa была обнаружена из окружающей среды 18 пациентов с МВ (36 %). В Российской Федерации такие исследования были ограниченны. Так, российские исследователи проводили оценку влияния микрофлоры объектов окружающей среды на возможность колонизации дыхательных путей пациентов с МВ г. Самары. Были выделены неферментирующие грам­отрицательные бактерии, имеющие клиническое значение при муковисцидозе, в т. ч. Achromobacter spp., Ralstonia spp., Pandorae spp. Бактерии P. aeruginosa не были обнаружены [16]. Наши исследования во внегоспитальных условиях внешней среды детей, больных МВ, выявили домашние очаги P. aeruginosa. В ходе исследования выявлены потенциальные резервуары и факторы передачи патогена, которыми являлись сливные отверстия раковин и контактные поверхности зубных щеток. А также показано, что P. aeruginosa может оставаться на маске после ингаляции; таким образом, данный объект при ненадлежащем уходе также может являться фактором передачи P. aeruginosa и требует тщательной обработки после каждого использования или замены.

К группе риска можно отнести 18,5 % детей, родственники которых имели хронические бронхолегочные заболевания. Дополнительным фактором риска может быть содержание домашних животных. Так, данные международной базы PubMLST (Public databases for molecular typing and microbial genome diversity) показывают случаи выявления у домашних кошек и собак в Японии и в Австралии бактерии P. aeruginosa эпидемически значимых сиквенс-­типов ST 235 и ST 274, которые ассоциированы с высоковирулентными и мультирезистентными штаммами у людей [20–30]. Этот потенциальный зооантропонозный резервуар требует дальнейшего изучения в контексте МВ.

Данные, полученные в результате генотипирования, свидетельствуют о циркуляции в бытовых условиях одного генотипа синегнойной палочки. Это создает риск реинфицирования и может объяснять неудачи эрадикационной терапии.

Анализ эффективности профилактических мер по дезинфекции камеры ингаляторов и сливных отверстий раковин показали, что они являются недостаточными. После проведения дезинфекции с поверхности 22 % объектов камера ингалятора высевались микроорганизмы. 41 % семей не выдерживали определенное время дезинфекции раковин. Для обеспечения эффективной дезинфекции сливов раковин требовалось проводить обработку длительностью более 6 часов. Кроме того, с фильтров ингаляторов и чистящей поверхности зубных щеток выделяли A. lwoffii, Aspergillus niger, Candida albicans и S. aureus, которые могут инфицировать легкие больного МВ, в том числе в ассоциации с P. aeruginosa. Поэтому данные объекты требуют частой замены при использовании пациентами с МВ. Мониторинг домашней среды в динамике подтвердил роль раковин как стабильных резервуаров бактерий P. aeruginosa, в которых они могут длительно сохраняться.

Полученные данные свидетельствуют о том, что домашняя среда является значимым и недооцененным резервуаром и фактором передачи P. aeruginosa для пациентов с муковисцидозом. Контаминация таких объектов, как сливы раковин, оборудование для ингаляционной терапии и средства гигиены, поддерживает цикл реинфекции, препятствуя эрадикации. Существующие бытовые практики дезинфекции часто оказываются неэффективными из-за несоблюдения протоколов и высокой устойчивости биопленок в сливах. Следовательно, обязательным для пациентов с муковисцидозом должен стать контроль за микробиологическими рисками в домашней среде, включающий регулярный мониторинг и строгие протоколы обработки ключевых объектов.

Вклад авторов / Author contribution

Е.А. Сиянова — разработка концепции и дизайна исследования, сбор материала, проведение исследования, обработка и анализ полученных данных, написание статьи.

М.Ю. Чернуха — разработка концепции и дизайна исследования, редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, общая ответственность.

Л.Р. Аветисян — разработка концепции и дизайна исследования, анализ полученных данных, редактирование статьи.

О.С. Медведева — сбор материала, обработка и анализ полученных данных.

А.Ю. Воронкова — разработка дизайна исследования, редактирование статьи.

Е.И. Кондратьева — разработка дизайна исследования, редактирование статьи.

E.M. Бурмистров — сбор материала, обработка и анализ полученных данных.

Н.Б. Поляков — обработка и анализ полученных данных.

А.И. Соловьев — обработка и анализ полученных данных.

В.Г. Жуховицкий — анализ полученных данных, редактирование.

E.K. Жекайте — сбор материала, обработка полученных данных.

Ekaterina A. Siyanova — development of research concept and design, collecting material, conducting research, data analysis, article writing.

Marina Yu. Chernukha — development of research concept and design, editing, approval of the final version of the article, overall responsibility.

Lusine R. Avetisyan — development of research concept and design, data analysis, manuscript revision.

Olga S. Medvedeva — collecting material, data processing, data analysis.

Anna Yu. Voronkova — development of research concept and design, manuscript revision.

Elena I. Kondratieva — development of research concept and design, manuscript revision.

Egor M. Burmistrov — data processing, data analysis.

Nikita B. Polyakov — data processing.

Andrey I. Solovyev — data processing.

Vladimir G. Zhukhovitsky — data analysis, manuscript revision.

Elena K. Zhekayte — collecting material, data processing.